SPI-DRY™ Secadores de Punto Crítico

Una introducción para aquellos que no están familiarizados con esta técnica

La Técnica
El secado de punto crítico es un método para secar tejidos sin que estos colapsen o deformen su estructura original, es decir, como cuando se encuentran húmedos y son frágiles. Este método es generalmente parte del proceso de preparación de muestras para Microscopía Electrónica de Barrido (SEM). Aunque se tienen algunas complicaciones para Microscopía Electrónica de Transmisiión (TEM), la aplicación más empleada de esta técnica es para microscopía SEM. Es bien sabido que dejar secar un tejido con aire convencional o al vacío (durante procesos de metalización, por ejemplo), genera daño a la superficies que se van a observar por SEM. Un ejemplo de esto se muestra en las imágenes que a continuación se muestran:


Imagen SEM imagen (850X) de la superficie de un pétalo de rosa, tratado por CPD	Imagen SEM imagen (850X) de la superficie de un pétalo de rosa, fijado y seco por aire

En algunos casos, esta deformación es aceptable durante experimentos de rutina, aunque la mayoría de las veces, esto no es así. En algún momento, trabajadores en este campo pretendieron no aceptar que este tipo de interferencias ocurrían en las muestras. Pero los usuarios en la actualidad, en la mayor parte del mundo, y con microscopios SEM de alta resolución, no toleran semejantes interferencias. Y por tanto, hay una aceptación generalizada de la necesidad del uso de una unidad de Secado de Punto Crítico en laboratorios de Ciencias de la Vida, e inclusive, bajo determinadas condiciones de trabajo, hasta en laboratorios de Ciencias de Materiales.

Explicación de los sistemas de secado:
La causa del por qué las muestras de tejido se dañan cuando se secan con aire se basa en las fuerzas de tensión que se crean en cavidades de pequeñas dimensiones donde hay una interfase líquido/gas. En la medida que el tejido se seca, la interfase líquido/gas viaja a través de la superficie del material colapsando las cavidades entre estructuras. En el caso de muestras delicadas que contienen líquido, se vuelven huecas durante el secado, puede generarse que la estructura colapse totalmente. El método de secado en punto crítico evita estos efectos, no permitiendo que se forme la inerfase líquido/gas; de esta forma el tejido no se expone a las fuerzas de tensión en la superficie.

El punto crítico:
El punto crítico de un sistema líquido/gas (por ejemplo agua/vapor, CO₂líquido/CO₂gas) es su temperatura crítica y la presión asociada con esta temperatura; es decir hay un punto T_c, P_c menor en el diagrama de fases T,P. Sobre la temperatura crítica, T_c el sistema es siempre gaseoso y no puede ser licuado por la aplicación de presión. La transición de líquido a gas en el punto crítico ocurre sin una interfase porque las densidades de líquido y gas son iguales en este punto. Si el tejido está totalmente inmerso en un líquido por debajo de su punto crítico y el líquido es entonces llevado a una temperatura y presión por arriba del punto crítico, entonces, la muestra está inmersa en gas (es decir, está "seca"), sin estar expuesta a las fuerzas de tensión de superficies que la pueda dañar.

Para llevar a cabo este procedimiento a una presión y temperatura adecuadas, es normal reemplazar el agua (que tiene un punto crítico muy alto) con otro líquido antes de efectuarse el secado. Más de una sustitución es necesaria si el líquido final no es miscible en agua; por ejemplo, si el líquido final el dióxido de carbono líquido en agua en el tejido es primeramente sustituido con acetona y posteriormente, la acetona se sustituye por CO₂ líquido.

Otra alternativa es agua-etanol-Freon® 113-CO₂. Sin embargo debido a los daños ambienales y la escasez generalizada de Freon 113, cualquier ruta que dependa de este compuesto ya no está en uso. El CO₂ líquido es el medio de secado más utilizado porque no es caro y es ecológicamente aceptado, en comparación con el Freon 113. El Oxido Nitoso también sa he usado para este propósito pero no ha tenido mucha aceptación.

Fijación con glutaraldehído and tetróxido de osmio seguido por la sustitución de acetona o Freon 113 se lleva a cabo antes de transferir el tejido al Secador de Punto Crítico La sustitución final con CO₂ líquido y la corrida de secado se llevan a cabo en el interior del aparato. Después de la corrida de secado, se libera la presión y el tejido seco puede entonces metalizarse antes de ser colocado dentro del SEM para su observación y análisis de imagen. Usualmente, el metal empleado es Oro y esto se hace mediante un Recubridor Sputter o Recubridor de Osmio.

La comparación de micrografías mostradas anteriormente muestran un ejemplo de tejido que se ha fijado en glutaraldehido y tetróxido de osmio, sustituido con etanol y posteriormente Freon 113; finalmente, se secó en punto crítico a partir de CO₂ líquido. La diferencia entre las dos micrografías mostradas muestra las obvias ventajas de utilizar la técnica de Secado en Punto Crítico para este tipo de muestras.

El Aparato
El cuerpo principal del equipo es un recipiente presurizado con una chaqueta de agua integrada para calentamiento y enfriamiento. El rango de operación normal de la cámara de presión es de 0-2000 psi y 10-50°C. Como puede apreciarse en la foto de la unidad, pueden verse varias válvulas de control, un termómetro, una válvula de presión y un soporte, todos ensamblados al recipiente. Al final de la cámara cilíndrica hay una ventana desmontable para observar el proceso, y en el extremo opuesto una puerta removible para colocar el soporte de la muestra. La ventana de observación es una parte indispensable del diseño de la unidad CPD de SPI porque es necesario asegurarse que no se genere turbulencia cuando el CO₂ se aplique a la unidad..

Hay cuatro válvulas de control de presión. Construida al interior de la columna de soporte es una válvula de seguridad, a veces conocida como "disco de ruptura", ajustada a 2000 psi. Si esta presión se excede por sobrecalentamiento de la cámara, la válvula se abre y reduce la presión llevando el equipo a presión ambiente. Este disco de ruptura debe ser reemplazado antes de que la unidad vuelva a ser utilizada.

La válvula manual en la parte superior trasera del cuerpo del equipo es usada para la entrada del gas líquido a la cámara. Una tubería de transfrencia con coples conecta el aparato a un cilindro sifón. La válvula manual en la parte superior frontal se usa como venteo del aire atrapado al momento de llenar la cámara. La válvula de la parte inferior trasera del equipo se usa para drenar el fluido de transferencia después de llenar con el gas líquido.

Tanto la válvula de venteo y de drenaje se usan para generar un mezclado cuando se sustituye el fluido de transferencia por el gas líquido. Es importante que todo el fluido de transferencia se remueva del tejido y se elimine de la cámara para asegurar un secado eficiente. La turbulencia y la remoción se logran abriendo las válvulas de entrada y el venteo simultáneamente.

Debe tenerse cuidado de asegurar que el tejido se mantenga bajo el nivel del líquido durante esta operación, y deberá evitarse la turbulencia se las muestras son especialmente frágiles, de tal modo que no se generen deformaciones o daños.

El soporte para tejido consiste en un recipiente en forma de "barco" donde se colocan canastillas con el tejido que va a secarse. Hay un drenaje automático en el recipiente que actúa cuando la puerta de acceso se cierra con el soporte dentro de la cámara. Este diseño cubre dos requerimientos: a)Que el tejido se mantenga húmedo durante su transferencia al aparato y b) El líquido de transferencia puede removerse totalmente antes de que se aplique la corrida de secado.

Tras colocar el líquido de transferencia (acetona, acetato de amilo), con el líquido de secado en punto crítico (por ejemplo, CO₂ líquido) puede iniciarse la corrida de secado. Todas las válvulas estan cerradas y el agua caliente está circulando a través de la chaqueta de la cámara. En el caso del CO₂ líquido, el elevar la temperatura de la cámara 32°C genera un incremento de presión de cerca de 800 psi a casi 1150 psi. A este punto el menisco líquido/gas se vuelve difuso y desaparece. Es este el punto donde la cámara contiene gas solamente. La válvula de venteo puede abrirse ligeramente y sangrar el gas para dejar el tejido seco. Para asegurar que no ocurra la recondensación del líquido, recomendamos que la temperatura se tome al menos 5 C° por arriba del punto crítico superior.

SEGURIDAD:
Debido a que hay pérdidas de presión durante el uso del aparato, estas son subsanadas cuando se usen sellos estándar de Nitrilo (O-rings). Para usar el equipo con solventes agresivos y acetona, recomaendamos el uso de sellos EPDM. Estos son un poco más costosos, pero tienen mayor durabilidad.

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