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SPI-Mark™ reactivos de oro coloidal: Protocolos

Etiquetado de fijación previa de antígenos de superficie de célula para EM


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Presentamos de buena fe estos protocolos a nuestros clientes. Han sido validados cuando se usan reactivos de oro coloidal SPI-Mark™, sin embargo, seríamos reluctantes de extrapolar los resultados que podrían obtenerse si se usan reactivos de marcas diferentes.

Protocolo:
  1. Aísle células de tejido con tripsinización o separado de células sanguíneas mediante centrifugado de gradiente.
  2. Prefije células en 0.1% Gluteraldehído grado EM de SPI-Chem™ o Paraformaldehído SPI-Chem al 2-4% en PBS, dependiendo de la sensibilidad del antígeno.
  3. Lave tres veces en PBS que contenga 50mm de glicina para enfriar rápidamente los aldehídos.
  4. haga bloques de células de 30 mm en PBS + 1% BSA + 10% de suero normal (especies de segundo anticuerpo) + 0.1% azida sódica, pH 7.4
  5. Lave dos veces en PBS + 1% BSA
  6. Incube con un amortiguador de anticuerpo primario en PBS + 1% BSA + 0.1% Tween 20 + 1% suero normal (segunda especie de anticuerpo) durante 1 hora.
  7. Lave dos veces en un amortiguador de incubación.
  8. Incube con un segundo anticuerpo con etiqueta de oro en un amortiguador de incubación (paso 6) durante 1 hora.
  9. Lave dos veces en PBS.
  10. Fije en gluteraldehído al 1% en PBS durante 15 mm.
  11. Lave dos veces en agua destilada o desionizada.


    12. Mejora opcional en plata:
  12. Mejora de plata durante 1-10 minutos para agrandar las partículas de oro usando el Kit de mejora de plata SPI-Chem
  13. Lave dos veces en agua destilada para detener la intensificación y remover las soluciones de plata.


    14. Incrustado:
  14. Gire hasta formar un perdigón y deshidrate en alcohol
  15. Incruste en epóxico, usando SPI-Pon™ 812 de SPI-Chem o un sistema de resina acrílica, como LR White™ o Unicryl™ o Lowicryl™ "original" o Lowicryl Monostep.
  16. Seccione y marque para EM o LM
Referencias
  1. C Ferrari, et al (1989) '~Pre-embedding immunogold staining of cell surface antigens performed on suspended cells and tissue sections" en Hayat MA, Oro coloidal, Vol. 2 (Ch 16)

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Friday March 19, 2010
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