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SPI-Mark™ Reactivos de oro coloidal

Introducción al marcaje con oro


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Introducción al marcaje con oro

Historia
Hace unos 50 años los marcajes fluorescentes eran conjugados con anticuerpos para la primera detección microscópica de antígenos en tejidos, En1970 las marcas enzimáticas proporcionaron por primera vez una tinción colorida permanente con resolución mayor y mejor estabilidad que las marcas fluorescentes. Con el advenimiento de las marcas con oro en 1971 la sensible inmunocitoquímica de alta resolución se hizo posible en el microscopio electrónico por primera vez. Los desarrollos subsiguientes de los métodos mejorados con plata permitieron que los marcajes con oro proveyeran de un método altamente específico y sensible para visualizar antígenos en la microscopía de luz,

Desde su introducción a la microscopía, los marcajes con oro han sido reconocidos como herramientas muy importantes para la detección y cuantificación de proteínas, antígenos, y ácidos nucléicos cuando se utilizan con otras técnicas tales como transferencia (blotting), citometría de flujo, hibridización e identificación de huella genética.

Más recientemente un uso muy importante para los conjugados de oro ha emergido en su incorporación a los inmunoensayos de prueba rápida. En estas técnicas los singulares colores rojos de la marca de oro acumulada, cuando se observan por medio de flujo lateral o transverso a lo largo de una membrana sobre la cual se captura el antígeno, o mediante la observación de la intensidad del color rojo en solución, proporciona un método extremadamente sensible para detectar cantidades de sub nanogramos en las proteínas en solución,

Sondas de oro
Los marcajes de oro actúan como señaladores para las moléculas que de otra manera serían invisibles al ojo o mediante otros sistemas de detección. Un conjugado de oro coloidal consiste de una suspensión de partículas de oro recubiertas con una proteína seleccionada o macromolécula (tal como un anticuerpo). Las partículas de oro pueden ser manufacturadas a cualquier tamaño que se escoja desde 1-250 nm. Este sistema de detección de sonda de oro cuando se incuba para un objetivo específico, tal como en una sección de tejido, revelará el objetivo a través de la visibilidad de las partículas de oro mismas.

En el microscopio electrónico las partículas son visibles sin tratamiento adicional. En el microscopio de luz, sin embargo, las partículas de oro se hacen visibles a través de un corto y simple procedimiento de mejoramiento con plata. Para la detección por el ojo, las partículas de oro también revelarán proteína inmovilizada en fase sólida tal como en una membrana de transferencia a través del color rojo acumulado del sol de oro. La mejora por plata de este precipitado de oro también proporciona sensibilidad de detección adicional.

Conjugación
La conjugación de proteínas selectas con las partículas de oro depende de por lo menos tres fenómenos físicos:
El oro se puede conjugar con una amplia variedad de moléculas incluyendo proteínas (i.e. anticuerpos), polipéptidos, carbohidratos, polímeros, polisacáridos, enzimas y ácidos nucleicos, Las condiciones bajo las que se prepara un conjugado de oro afectan drásticamente su desempeño y estabilidad.

¿Por qué oro?
Existen varias ventajas al escoger partículas de oro como marcadores para identificación microscópica y no microscópica de moléculas objetivo.

La elección del tamaño de partícula hace posible el estudiar microscópicamente antígenos, sobre una amplia gama de aumentos y proporciona la oportunidad para marcaje múltiple de antígenos en secciones tisulares. En el microscopio electrónico el marcaje con partículas de oro es completamente inequívoco. La marca no puede ser confundida con cualquier otra estructura tisular y simplemente está, o no está presente. La resolución de este marcaje tanto en EM como LM es pues, mayor que con cualquier otro método.

Con marcajes fluorescentes y color basado en enzimas las reacciones pueden desteñirse con el tiempo y la exposición a la luz. Las partículas de oro no desaparecen sino más bien dan un marcaje permanente. A causa de la naturaleza de la marca con oro, es posible la cuantificación en el microscopio electrónico, aún para más de un antígeno a través de múltiple marcaje con diferente tamaño de partícula. En el microscopio de luz, la tinción intensa café/negra producida por la mejora con plata de la señal de oro, ha mostrado dar generalmente una sensibilidad mayor, y mucho mejor resolución que otros métodos inmunocitoquímicos; y los tejidos se pueden contrateñir por todos los procedimientos habituales de tinción.

A diferencia de algunos sistemas de detección basados en enzimas, las sondas de oro son esencialmente no tóxicas, seguras y fáciles de usar. La buena estabilidad de un conjugado de oro bien hecho, da al producto una larga vida de anaquel ya sea congelado o almacenado a 4 °C. Para la tinción de proteínas inmovilizadas sobre membranas, las sondas de oro tienen una sensibilidad de detección y de resolución inigualada. Finalmente, y quizá en forma sorprendente, las sondas de oro resultan económicas de usar y su alta sensibilidad permite diluir significativamente valiosos anticuerpos primarios, mucho más que con otros sistemas,

Distribución de tamaño de los conjugados de oro SPI-Mark


¿Qué determina la alta calidad? Varias características esenciales se deben asignar a las sondas de oro si es que se les va a considerar como reactivos confiables de alta calidad, para investigación experimental y de diagnóstico.

Anticuerpos y proteínas
Para empezar con las materias primas, todos los anticuerpos y proteínas utilizados para la conjugación deben ser purificados para afinidad, con las más alta calidad. Deben poseer muy fuerte afinidad por el antígeno específico y tener gran avidez para soportar las condiciones severas de incubación y de lavado. La reactividad cruzada debe ser tan baja como sea posible. Utilizamos solamente anticuerpos y proteínas de muy alta calidad en la manufactura de los reactivos SPI-Mark; esta política ha sido premiada con productos confiables en forma consistente. Política que se extiende hasta los métodos de empaque y embarque por SPI , pues esta clase de productos solamente se embarcan refrigerados a través de un servicio de paquetería, para asegurar que nada ha sucedido en el tránsito que degrade la integridad del producto, antes de que éste llegue a las manos del cliente final.

Coloides de oro
El desarrollo en nuestros Laboratorios de Técnicas Especiales para producir coloides de oro y plata puros con el coeficiente de variación (CV) de tamaño de partícula más bajo disponible, significa que nuestros conjugados de oro son consistentes de un lote a otro y dan el mismo alto desempeño una y otra vez.

Sensibilidad y estabilidad
La sensibilidad es del todo importante en el inmunomarcaje para detección de bajos niveles de antígenos en células y tejidos. Para que una sonda de oro produzca una fuerte señal específica con un fondo bajo, la conjugación del anticuerpo a la partícula debe ser completa y estable bajo una variedad de condiciones de incubación. La partícula de oro debe tener un efecto mínimo sobre la actividad del anticuerpo al cual está conjugado, pero debe estar absorbida en forma suficientemente fuerte a la superficie para permanecer estable por años. Para el almacenaje de largo plazo debería ser posible congelar un conjugado de oro sin pérdida de la actividad del anticuerpo. Todos los conjugados de oro estándar SPI-Mark pueden ser congelados y almacenados por largos intervalos de tiempo sin deterioro.

Apelmazado
Para la microscopía electrónica es importante un nivel de arracimado muy bajo, especialmente si se va a llevar a cabo una cuantificación o se requieren micrografías de alta calidad. El apelmazamiento indica una absorción pobre de proteína con puenteo entre partículas de oro. Los conjugados severamente apelmazados tienen una baja estabilidad y pobre estabilidad. En lo referente a los conjugados de oro, deben tener por lo menos un mínimo de 85% de singuletes y ciertamente ningún racimo mayor a triplete. Todos los conjugados de oro SPI-Mark grado EM están fabricados bajo esta alta especificación.

Aseguramiento de la calidad
Los estrictos procedimientos de aseguramiento de la calidad utilizados en todas las etapas de la manufactura de los reactivos de oro SPI-Mark, aseguran que todos estos criterios se cumplan en su totalidad y que nuestros productos tengan la especificación y el desempeño más altos.

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Thursday March 18, 2010
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